Рекомбинантные реактивы – оперативный и экологичный метод тестирования эндотоксинов
Десятилетиями инструментом выявления эндотоксинов в фармацевтических исследованиях были лизаты амебоцитов животного происхождения. А в 1990-х годах начали использоваться рекомбинантные реактивы, которые стали настоящим прорывом в этой сфере. Преимущества метода доступны и украинским фармпредприятиям благодаря компании «Химлаборреактив», официально представляющей Associates of Cape Cod, Inc. – передового мирового производителя продуктов и сервисов для определения бактериальных эндотоксинов и бета-глюканов. В своей статье научные сотрудники ГП «Украинский научный фармакопейный центр качества лекарственных средств» (Харьков) и специалисты ХЛР рассказывают об особенностях и преимуществах новейших реактивов.
Основой для метода анализа бактериальных эндотоксинов стала открытая в 1956 году медицинскими исследователями Фредериком Бенгом и Джеком Левином реакция свертывания крови у древнейших представителей типа членистоногих из существующих на планете – мечехвостов атлантических (Limulus polyphemus). В результате реакции эндотоксина и амебоцитарного лизата мечехвоста (Limulus Amebocyte Lysate, LAL) мутнеет прозрачная реакционная смесь или образуется твердый гель. Фармакопейное испытание лекарственных средств и медицинских изделий на бактериальные эндотоксины в тесте in vitro официально признано в 1980 году, когда его впервые внесли в Фармакопею США 20-го издания. А в 1999 году на 104-й сессии Европейской Фармакопеи LAL-тест назван основным методом контроля качества лекарственных средств. Стратегией Европейской Фармакопеи в этом направлении было постепенно заменить им тест на пирогенность на животных в максимально возможном количестве препаратов.
Исследование без проблем с чувствительностью природного лизата
Ежегодно для производства реактива в водах Атлантики вылавливают примерно 6000 мечехвостов, что очень вредит популяции реликтового вида. Осознавая это, компания Associates of Cape Cod Inc. (США), ведущий производитель реактивов для тестов на бактериальные эндотоксины, разработала новые реактивы из рекомбинантного белка вместо лизата животного происхождения.
Использование любого натурального ингредиента влечет за собой значительную вариабельность в чувствительности природного лизата. К основным факторам относятся: пол, возраст, размер мечехвостов, особенности конкретной среды их жизни, сезон и время забора гемолимфы, активность ферментной системы лизата, выраженность которой генетически детерминирована. Естественный лизат содержит и ряд других белков, по крайней мере десять из них участвуют в антимикробном ответе и могут либо препятствовать, либо усиливать его коагуляционную активность.
Каждый поставщик получает и очищает лизат особым способом: экстрагирует составляющие хлороформом, оставляет в лиофилизате денатурированные белки, добавляет буферные растворы и детергенты – дополнительный источник изменчивости. Все это – факторы влияния на чувствительность полученного реактива к бактериальным эндотоксинам и причины значительных отличий в результатах анализа лекарственных средств. Ученые склонны считать, что рекомбинантные белки более стабильны, а соответственно, можно получать сравнительные результаты испытаний.
Лизат биологического происхождения имеет еще один недостаток – в гемоцитах лизата действует альтернативный механизм активации процессов гелеобразования через глюкан-чувствительный фактор G (путь фактора G). Десять лет лизатом амебоцитов Limulus контролировали фармацевтическую продукцию, а затем произошло потрясающее открытие – способность других материалов, а именно (1,3)-β-D-глюканов, которые являются компонентом клеточных стенок дрожжевых и других грибов, вызывать ложноположительную реакцию препарата, когда бактериальных эндотоксинов в препарате мало или вообще отсутствуют.
Будущее – за рекомбинантными каскадными реактивами
Специалисты по генной инженерии уже давно изучают и испытывают коагуляционную систему мечехвостов. В частности, супруги-ученые из Национального университета Сингапура – Динг Джик Линг и Хо Боу – поняли, какой огромный потенциал имеет синтезированный в лабораторных условиях рекомбинантный фактор С для разработки технологии выявления эндотоксинов без использования животных. В 1995 году исследователи клонировали полноразмерный фактор С, а в 1997 клонировали и экспрессировали рекомбинантный фактор С (rFC) у разных хозяев. Благодаря экспериментам Динг Джик Линг и Хо Боу установлено, что при одинаковых условиях анализа rFC имеет более низкие фоновые показатели и более чувствительный ответ на эндотоксин по сравнению с использованием коммерческого LAL-реактива.
Переход к коммерческому производству рекомбинантных реактивов означал новую эпоху в количественной диагностике эндотоксинов. Первый коммерческий реактив на основе рекомбинантного фактора С для микрофлуорометрического анализа эндотоксинов появился в 2004 году, не заставили себя ждать и другие разработки. А уже в апреле 2021 года Associates of Cape Cod., Inc. (США) совместно с японской компанией Seikagaku Corporation вывела на рынок рекомбинантный каскадный реактив (rCR) PyroSmart NextGen™, клонированный из генов Limulus polyphemus, который, подобно коагуляционной системе мечехвоста, содержит все ферменты процесса коагуляции – факторы В и С и свертывающий фермент вместе с хромогенным субстратом, но исключает β-глюкан-специфический белок фактора G.
Рекомбинантный реактив PyroSmart NextGen® количественно выявляет бактериальные эндотоксины с помощью хромогенного кинетического метода, который является дальнейшей эволюцией гель-тромб- и турбидиметрических тестов. Хромогенный метод основывается на количественной зависимости, которая имеет интенсивность окраски реакционной смеси от концентрации эндотоксинов: большее содержание эндотоксина способствует тому, что фермент быстрее расщепляет субстрат – но не коагулоген, как в природе, а хромогенный пара-нитроанилин (pNA), это дает насыщенный желтый.
Таблица 1. Сравнительный анализ хромогенного кинетического метода с PyroSmart NextGen® и лизатом амебоцитов
|
Показатель и характеристика |
PyroSmart NextGen™ |
Лизат амебоцитов Limulus |
|
Оборудование |
Инкубационный мікропланшетний ридер, например, BioTek® ELx808™ |
Ридер для пробирок или инкубационный микропланшетный ридер |
|
Длина волны, нм |
405 нм / 490 (492)* |
405 |
|
Программное обеспечение |
Позволяет обрабатывать данные по времени начала достижения определенной оптической плотности или по скорости реакции, например, Gen5™, Pyros® eXpress |
|
|
Состав набора |
Реагент и буферный раствор для восстановления (PyroSmart NextGen® Reagent / PyroSmart NextGen® Reconstitution Buffer) |
Реагент и буферный раствор для восстановления |
|
Условия хранения реактивов, °C |
5 ± 3 |
|
|
Состав реагента |
Три рекомбинантных белка:
|
Четыре рекомбинантных белка:
|
|
Глюкан-блокировочный буферный раствор |
Не применяется |
Glucashield® buffer |
|
Чувствительность метода, МО/мл |
0,005 |
0,001 |
|
Микропланшеты |
96-луночные микропланшеты с крышкой, свободные от бактериальных эндотоксинов и глюканов |
|
|
Смешиваемые объемы мл |
0,05 |
0,05 / 0,1 |
|
Температура реакции, °C |
37 ± 1 |
|
|
Время инкубации, мин |
30–60 |
60–90 |
|
Интервалы считывания во время инкубации, с |
30* |
10–30 |
|
Критерий пригодности (коэффициент корреляции стандартной кривой) |
≥ 0,98 |
|
* зависит от возможностей планшетного ридера
Биотехнологическое производство PyroSmart NextGen® гарантирует стабильный продукт во всех партиях, на чувствительность которого к эндотоксинам не влияет изменчивость природных белков. Высокое качество rCR подтверждается надежностью и хорошей воспроизводимостью критериев пригодности стандартной кривой и постоянством параметров реакции коагуляции.
Уже подтверждено, что PyroSmart NextGen® и лизат амебоцитов Limulus превосходят эффективность rFC к выявлению автохтонных эндотоксинов микрофлоры воды, поэтому является самым распространенным сырьем на фармацевтическом предприятии.
Компания Associates of Cape Cod. Inc провела ряд экспериментов, результаты которых свидетельствуют, что реактив PyroSmart NextGen® проявляет определенные преимущества при тестировании интенсивно окрашенных растворов по сравнению с лизатами животного происхождения для хромогенного и турбидиметрического методов.
В исследовании, выполненном ученым Масаши Мурои и его коллегами в 2019 году, рекомбинантные реактивы PyroSmart и rFC и пять лизатов животного происхождения продемонстрировали при идентичных условиях анализа сравнительную реакционную способность к эндотоксинам 13 различных штаммов грамотрицательных бактерий. В этом эксперименте не только не зафиксировали существенных отличий в результатах анализа 109 образцов парентеральных препаратов, а рекомбинантные реагенты даже характеризовались от серии к серии заметно более высокой воспроизводимостью результатов, чем лизаты амебоцитов. Авторы считают это довольно красноречивой демонстрацией того, что рекомбинантные реагенты, в частности PyroSmart – чрезвычайно надежный инструмент, равноценный или лучший, чем природный лизат амебоцитов, и пригодный для рутинных испытаний эндотоксинов на фармпредприятии.
Признание ведущими фармакопеями мира
Тестирование эндотоксинов с использованием рекомбинантных реактивов постепенно принимают ведущие фармакопеи мира. С 1 января 2021 года в Европейской Фармакопее вступила в силу общая статья «Test for bacterial endotoxins using recombinant factor C» (2.6.32), которая ссылается на флуорометрический метод определения эндотоксинов с рекомбинантным фактором С. В том же году в Фармакопее (rCR) и (rFC) в качестве альтернативных тестов («Bacterial Endotoxins Test and Alternative Methods using Recombinant Protein-reagents for Endotoxin Assay»), в частности что анализ эндотоксинов с некоторыми из рекомбинантных белковых реагентов проявляет одинаковую или лучшую чувствительность и специфичность. Фармакопея США рассматривает эти методы как альтернативные в общей статье <86> «Bacterial endotoxins test using recombinant reagents», действующей с 1 мая 2025 года.
В своих экспериментальных исследованиях мы оценивали аналитические характеристики (правильность, линейность, прецизионность, диапазон применения и пределы количественного определения) в соответствии с требованиями общей статьи «Валидация аналитических методик и испытаний» (5.3.N.2., ГФУ 2.4), Руководства ICH Q2 и USP <1
Использовался рекомбинантный реактив PyroSmart NextGen® и стандартный препарат эндотоксина CSE (Escherichia coli O113:H10), предоставленный компанией Associates of Cape Cod, Inc. при посредничестве ООО «Химлаборреактив». Для исследования применен хромогенный кинетический метод в режиме «Onset time assay» при длине волны 405 нм на микропланшетном ридере ELx808 производства компании BioTek Instruments Inc. (США). В качестве лизата амебоцитов использовали Pyrochrome® от Associates of CAPE COD, Inc. (США).
Аналитические характеристики и критерии приемлемости испытания с использованием рекомбинантного реактива PyroSmart NextGen® приведены в табл. 2. Стандартные кривые для определения эндотоксинов, полученные с помощью PyroSmart NextGen®, удовлетворяли критерию надежности (r ≥ 0,980) и равнялись 0,998–1,0 (см. рисунок).
Таблица 2. Параметры регрессионного анализа содержания бактериальных эндотоксинов из PyroSmart NextGen® и лизатом амебоцитов
|
Требование |
Реактив / тест-набор |
||
|
PyroSmart NextGen® |
Лизат амебоцитов Limulus |
Критерий приемлемости |
|
|
Линейность |
|||
|
Коэффициент корреляции ǀrǀ в диапазоне концентраций эндотоксинов, указанных изготовителем, МО/мл |
ǀrǀ =1,00 (max) ǀrǀ = 0,998 (min) 0,005–50 |
ǀrǀ = 1,00 (max) ǀrǀ = 0,993 (min) 0,005–5 |
ǀrǀ ≥ 0,980 |
|
Правильность |
|||
|
Концентрация добавленных эндотоксинов, МО/мл |
Количество выявленных эндотоксинов, (min – max, %) |
50–200 % |
|
|
0,005 0,05 0,5 5 50 |
100,0–120,0 90,0–96,0 90,4–110,6 85,4–97,9 98,8–1000 |
100,0–120,0 84,0–142,9 108,2–110,2 78,9–87,4 – |
|
|
Прецизионность – сходимость |
|||
|
Концентрация добавленных эндотоксинов, МО/мл |
Коэффициент вариации (min CV – max CV, %) |
CV ≤ 25 % (0,005 МО/мл) CV ≤ 20 % (0,05–50 МО/мл) |
|
|
0,005 0,05 0,5 5 50 |
15,63–24,08 13,41–20,64 6,82–21,22 4,87–8,53 – |
2,56 3,73–10,29 3,23–29,23 1,63–6,46 – |
|
|
Диапазон применения |
|||
|
0,005 – 50 МО/мл |
Удовлетворительные результаты исследований валидационных характеристик прецизионность, правильность и линейность свидетельствуют, что методика обеспечивает линейность, правильность и прецизионность в пределах исследованного диапазона применения. |
||
|
Предел количественного определения |
|||
|
0,005 МО/мл |
Правильность: 100,0–120,0 % Прецизионность: 15,63–24,08 % |
Удовлетворительные результаты исследований прецизионность и правильность для самой низкой концентрации |
|
Рисунок. График зависимости сигнала как функции концентрации эндотоксинов (стандартная кривая получена с помощью PyroSmart NextGen®)
Ось ординат (Y) – «время начала»; ось абсцисс (X) – «концентрация»
Визуальная оценка графика зависимости сигнала как функции концентрации эндотоксинов свидетельствует о наличии линейной зависимости (см. рисунок).
Как видно из табл. 2, восстановление добавленного эндотоксина в процентах от известной концентрации добавленных эндотоксинов удовлетворяет критерию приемлемости для проверки мешающих факторов, как описано в общей статье ГФУ 2.6.14, то есть 50–200 %. Диапазон составляет 0,005–50 МЕ/мл, нижний предел количественного определения – 0,005 МЕ/мл (см. табл. 2).
Краткие итоги
Подытоживая массив данных по научным публикациям, информационно-справочных материалов компании Associates of Cape Cod. Inc., а также результаты собственных экспериментальных исследований, можем говорить о ряде преимуществ, присущих рекомбинантному реактиву (rCR) по сравнению с лизатом амебоцитов животного происхождения. Основные из них:
- Меньшая вариабельность реагента от партии к партии, что повышает внутрилабораторную сопоставимость результатов и воспроизводимость критериев пригодности стандартной кривой
- Исключение ложноположительных результатов из-за индифферентности к (1,3)-β-D-глюканам и (1→4)-β-D-глюканам)
- Высшая реакционная способность Helicobacter pylori GU2 в экспериментальных исследованиях с использованием PyroSmart NextGen®, чем у других рекомбинантных реагентов (rFC), и существенно ниже мешающий уровень влияния кальция гепарина
- Выявление преимуществ при анализе интенсивно окрашенных растворов
- Содействие меньшему использованию животных в фармакопейном контроле в соответствии с принципом 3Rs
ООО «Химлаборреактив», официальный представитель компании Associates of Cape Cod в Украине, обеспечивает:
- Большой выбор реактивов и систем для анализа содержания эндотоксинов
- Методическое сопровождение, консультации и подбор оптимального решения для любого препарата (специалисты ХЛР постоянно обучаются на базе мощностей производителя)
- Поставку с соблюдением условий перевозки и хранения на сертифицированном складе
Обращайтесь в компанию «Химлаборреактив», и вы получите лучшие решения для контроля качества в фармацевтической отрасли!
Татьяна Леонтьева,
научный сотрудник лаборатории фармакопейного анализа ГП «Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів», Харьков
Юлия Меркулова,
канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории фармакопейного анализа ГП «Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів», эксперт Европейской фармакопеи
Анна Журба,
ведущий специалист Отдела химических реактивов компании ХЛР