Рекомбінантні реактиви – оперативний і екологічний метод тестування ендотоксинів
Десятиліттями інструментом виявлення ендотоксинів у фармацевтичних дослідженнях були лізати амебоцитів тваринного походження. А в кінці 1990-х років почали використовуватися рекомбінантні реактиви, які стали справжнім проривом у цій сфері. Переваги методу доступні й українським фармпідприємствам завдяки компанії «Хімлаборреактив», яка офіційно представляє Associates of Cape Cod, Inc. – передового світового виробника продуктів та сервісів для визначення бактеріальних ендотоксинів і бета-глюканів. У своїй статті наукові співробітники ДП «Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів» (Харків) і фахівці ХЛР розповідають про особливості й переваги новітніх реактивів.
Основою для методу аналізу бактеріальних ендотоксинів стала відкрита в 1956 році медичними дослідниками Фредеріком Бенгом і Джеком Левіном реакція згортання крові в найдавніших представників типу членистоногих із тих, які існують на планеті, – мечохвостів атлантичних (Limulus polyphemus). У результаті реакції ендотоксину й амебоцитарного лізату мечохвоста (Limulus Amebocyte Lysate, LAL) мутніє прозора реакційна суміш або утворюється твердий гель. Фармакопейне випробування лікарських засобів і медичних виробів на бактеріальні ендотоксини в тесті in vitro офіційно визнано 1980 року, коли його вперше внесли до Фармакопеї США 20-го видання. А в 1999-му на 104-й сесії Європейської Фармакопеї LAL-тест названо основним методом контролю якості лікарських засобів. Стратегією Європейської Фармакопеї в цьому напрямку було поступово замінити ним тест на пірогенність на тваринах у максимально можливій кількості препаратів.
Дослідження без проблем із чутливістю природного лізату
Щорічно для виробництва реактиву у водах Атлантики виловлюють приблизно 6000 мечохвостів, що дуже шкодить популяції реліктового виду. Усвідомлюючи це, компанія Associates of Cape Cod Inc. (США), провідний виробник реактивів для тестів на бактеріальні ендотоксини, розробила нові реактиви з рекомбінантного білка замість лізату тваринного походження.
Використання будь-якого натурального інгредієнта спричиняє значну варіабельність у чутливості природного лізату. До основних факторів належать: стать, вік, розмір мечохвостів, особливості конкретного середовища їхнього життя, сезон і час забору гемолімфи, активність ферментної системи лізату, вираженість якої є генетично детермінованою. Природний лізат містить і низку інших білків, принаймні десять із них беруть участь в антимікробній відповіді й можуть або перешкоджати, або посилювати його коагуляційну активність.
Кожен постачальник отримує та очищує лізат в особливий спосіб: екстрагує складові хлороформом, залишає в ліофілізаті денатуровані білки, додає буферні розчини й детергенти – додаткове джерело мінливості. Усе це – фактори впливу на чутливість отриманого реактиву до бактеріальних ендотоксинів і причини значних відмінностей у результатах аналізу лікарських засобів. Тож науковці схильні вважати, що рекомбінантні білки більш стабільні, а відповідно, можна отримувати порівнянні результати випробувань.
Лізат біологічного походження має ще один недолік – у гемоцитах лізату діє альтернативний механізм активації процесів гелеутворення через глюкан-чутливий фактор G (шлях фактора G). Десять років лізатом амебоцитів Limulus контролювали фармацевтичну продукцію, а потім сталося приголомшливе відкриття – здатність інших матеріалів, а саме (1,3)-β-D-глюканів, які є компонентом клітинних стінок дріжджових та інших грибів, спричиняти хибнопозитивну реакцію, коли бактеріальних ендотоксинів у препараті мало або взагалі відсутні.
Майбутнє – за рекомбінантними каскадними реактивами
Фахівці з генної інженерії вже давно вивчають і випробовують коагуляційну систему мечохвостів. Зокрема, подружжя науковців із Національного університету Сінгапуру – Дінг Джик Лінг і Хо Боу – зрозуміло, який величезний потенціал має синтезований у лабораторних умовах рекомбінантний фактор С для розроблення технології виявлення ендотоксинів без використання тварин. У 1995 році дослідники клонували повнорозмірний фактор С, а в 1997-му клонували й експресували рекомбінантний фактор С (rFC) у різних хазяїв. Завдяки експериментам Дінг Джик Лінг і Хо Боу встановлено, що за однакових умов аналізу rFC має нижчі фонові показники й більш чутливу відповідь на ендотоксин порівняно з використанням комерційного LAL-реактиву.
Перехід до комерційного виробництва рекомбінантних реактивів означав нову епоху в кількісній діагностиці ендотоксинів. Перший комерційний реактив на основі рекомбінантного фактора С для мікрофлуорометричного аналізу ендотоксинів з’явився у 2004 році, не забарилися й інші розробки. А вже у квітні 2021-го Associates of Cape Cod., Inc. (США) спільно з японською компанією Seikagaku Corporation вивела на ринок рекомбінантний каскадний реактив (rCR) PyroSmart NextGen™, клонований із генів Limulus polyphemus, який, подібно до коагуляційної системи мечохвоста, містить усі ферменти процесу коагуляції – фактори В та С і згортальний фермент разом із хромогенним субстратом, але виключає β-глюкан-специфічний білок фактора G.
Рекомбінантний реактив PyroSmart NextGen® кількісно виявляє бактеріальні ендотоксини за допомогою хромогенного кінетичного методу, що є подальшою еволюцією гель-тромб- і турбідиметричного тестів. Хромогенний метод ґрунтується на кількісній залежності, яку має інтенсивність забарвлення реакційної суміші від концентрації ендотоксинів: більший вміст ендотоксину сприяє тому, що фермент швидше розщеплює субстрат – але не коагулоген, як у природі, а хромогенний пара-нітроанілін (pNA), це дає насичений жовтий колір (табл. 1).
Таблиця 1. Порівняльний аналіз хромогенного кінетичного методу з PyroSmart NextGen® і лізатом амебоцитів
|
Показник і характеристика |
PyroSmart NextGen™ |
Лізат амебоцитів Limulus |
|
Обладнання |
Інкубаційний мікропланшетний ридер, наприклад, BioTek® ELx808™ |
Ридер для пробірок або інкубаційний мікропланшетний ридер |
|
Довжина хвилі, нм |
405 нм / 490 (492)* |
405 |
|
Програмне забезпечення |
Дає змогу обробляти дані за «часом початку» досягнення визначеної оптичної густини або за швидкістю реакції, наприклад, Gen5™, Pyros® eXpress |
|
|
Склад набору |
Реагент і буферний розчин для відновлення (PyroSmart NextGen® Reagent / PyroSmart NextGen® Reconstitution Buffer) |
Реагент і буферний розчин для відновлення |
|
Умови зберігання реактивів, °C |
5 ± 3 |
|
|
Склад реагенту |
Три рекомбінантні білки:
|
Чотири рекомбінантні білки:
|
|
Глюкан-блокувальний буферний розчин |
Не застосовується |
Glucashield® buffer |
|
Чутливість методу, МО/мл |
0,005 |
0,001 |
|
Мікропланшети |
96-лункові мікропланшети з кришкою, вільні від бактеріальних ендотоксинів і глюканів |
|
|
Об’єми, що змішуються, мл |
0,05 |
0,05 / 0,1 |
|
Температура реакції, °C |
37 ± 1 |
|
|
Час інкубації, хв |
30–60 |
60–90 |
|
Інтервали зчитування під час інкубації, с |
30* |
10–30 |
|
Критерій придатності (коефіцієнт кореляції стандартної кривої) |
≥ 0,98 |
|
* залежить від можливостей планшетного ридера
Біотехнологічне виробництво PyroSmart NextGen® гарантує стабільний продукт у всіх партіях, на чутливість якого до ендотоксинів не впливає мінливість природних білків. Висока якість rCR підтверджується надійністю й доброю відтворюваністю критеріїв придатності стандартної кривої та сталістю параметрів реакції коагуляції.
Уже підтверджено, що PyroSmart NextGen® і лізат амебоцитів Limulus перевершують ефективність rFC до виявлення автохтонних ендотоксинів мікрофлори води, тому є найпоширенішою сировиною на фармацевтичному підприємстві.
Компанія Associates of Cape Cod. Inc провела низку експериментів, результати яких свідчать, що реактив PyroSmart NextGen® виявляє певні переваги за умов тестування інтенсивно забарвлених розчинів порівняно з лізатами тваринного походження для хромогенного й турбідиметричного методів.
У дослідженні, виконаному вченим Масаші Мурої та його колегами у 2019 році, рекомбінантні реактиви PyroSmart і rFC та п’ять лізатів тваринного походження продемонстрували за ідентичних умов аналізу порівнянну реакційну здатність до ендотоксинів 13 різних штамів грамнегативних бактерій. У цьому експерименті не лише не зафіксували істотних відмінностей у результатах аналізу 109 зразків парентеральних препаратів, а рекомбінантні реагенти навіть характеризувалися від серії до серії помітно вищою відтворюваністю результатів, ніж лізати амебоцитів. Автори вважають це досить промовистою демонстрацію того, що рекомбінантні реагенти, зокрема PyroSmart – надзвичайно надійний інструмент, рівноцінний або й кращий за природний лізат амебоцитів, і придатний для рутинних випробувань ендотоксинів на фармпідприємстві.
Визнання провідними фармакопеями світу
Тестування ендотоксинів із використанням рекомбінантних реактивів поступово приймають провідні фармакопеї світу. З 1 січня 2021 року в Європейській Фармакопеї набрала чинності загальна стаття «Test for bacterial endotoxins using recombinant factor C» (2.6.32), яка посилається на флуорометричний метод визначення ендотоксинів із рекомбінантним фактором С. Того ж року у Фармакопеї Японії опубліковано загальну інформацію щодо використання рекомбінантних реактивів (rCR) і (rFC) як альтернативних тестів («Bacterial Endotoxins Test and Alternative Methods using Recombinant Protein-reagents for Endotoxin Assay »), зокрема що аналіз ендотоксинів із деякими з рекомбінантних білкових реагентів виявляє однакову чи кращу чутливість і специфічність, ніж у методі з використанням реактивів лізату. А Фармакопея США розглядає ці методи як альтернативні в загальній статті <86> «Bacterial endotoxins test using recombinant reagents», чинній з 1 травня 2025 року.
У власних експериментальних дослідженнях ми оцінювали аналітичні характеристики (правильність, лінійність, прецизійність, діапазон застосування й межі кількісного визначення) відповідно до вимог загальної статті «Валідація аналітичних методик і випробувань» (5.3.N.2., ДФУ 2.4), Інструкції ICH Q2 та USP <1225>.
Використовувався рекомбінантний реактив PyroSmart NextGen® і стандартний препарат ендотоксину CSE (Escherichia coli O113:H10), які надала компанія Associates of Cape Cod, Inc. за посередництва ТОВ «Хімлаборреактив». Для дослідження застосовано хромогенний кінетичний метод у режимі «Onset time assay» за довжини хвилі 405 нм на мікропланшетному ридері ELx808 виробництва компанії BioTek Instruments Inc. (США). Як лізат амебоцитів використовували Pyrochrome® від Associates of Cape Cod, Inc. (США).
Аналітичні характеристики й критерії прийнятності випробування з використанням рекомбінантного реактиву PyroSmart NextGen® наведено в табл. 2. Стандартні криві для визначення ендотоксинів, отримані за допомогою PyroSmart NextGen®, задовольняли критерій надійності (|r| ≥ 0,980) і дорівнювали 0,998–1,0 (див. рисунок).
Таблиця 2. Параметри регресійного аналізу вмісту бактеріальних ендотоксинів із PyroSmart NextGen® і лізатом амебоцитів
|
Вимога |
Реактив / тест-набір |
||
|
PyroSmart NextGen® |
Лізат амебоцитів Limulus |
Критерій прийнятності |
|
|
Лінійність |
|||
|
Коефіцієнт кореляції ǀrǀ в діапазоні концентрацій ендотоксинів, зазначених виробником, МО/мл |
ǀrǀ =1,00 (max) ǀrǀ = 0,998 (min) 0,005–50 |
ǀrǀ = 1,00 (max) ǀrǀ = 0,993 (min) 0,005–5 |
ǀrǀ ≥ 0,980 |
|
Правильність |
|||
|
Концентрація доданих ендотоксинів, МО/мл |
Кількості виявлених ендотоксинів, (min – max, %) |
50–200 % |
|
|
0,005 0,05 0,5 5 50 |
100,0–120,0 90,0–96,0 90,4–110,6 85,4–97,9 98,8–1000 |
100,0–120,0 84,0–142,9 108,2–110,2 78,9–87,4 – |
|
|
Прецизійність – збіжність |
|||
|
Концентрація доданих ендотоксинів, МО/мл |
Коефіцієнт варіації (min CV – max CV, %) |
CV ≤ 25 % (0,005 МО/мл) CV ≤ 20 % (0,05–50 МО/мл) |
|
|
0,005 0,05 0,5 5 50 |
15,63–24,08 13,41–20,64 6,82–21,22 4,87–8,53 – |
2,56 3,73–10,29 3,23–29,23 1,63–6,46 – |
|
|
Діапазон застосування |
|||
|
0,005–50 МО/мл |
Задовільні результати досліджень валідаційних характеристик прецизійність, правильність і лінійність свідчать, що методика забезпечує лінійність, правильність і прецизійність у межах дослідженого діапазону застосування |
||
|
Межа кількісного визначення |
|||
|
0,005 МО/мл |
Правильність: 100,0–120,0 % Прецизійність: 15,63–24,08 % |
Задовільні результати досліджень прецизійність і правильність для найнижчої концентрації |
|
Рисунок. Графік залежності сигналу як функції концентрації ендотоксинів (стандартну криву отримано за допомогою PyroSmart NextGen®)
Вісь ординат (Y) – «час початку»; вісь абсцис (X) – «концентрація»
Візуальна оцінка графіка залежності сигналу як функції концентрації ендотоксинів свідчить про наявність лінійної залежності (див. рисунок).
Як видно з табл. 2, відновлення доданого ендотоксину у відсотках від відомої концентрації доданих ендотоксинів задовольняє критерій прийнятності для перевірки факторів, що заважають, як описано в загальній статті ДФУ 2.6.14, тобто 50–200 %. Діапазон становить 0,005–50 МО/мл, нижня межа кількісного визначення – 0,005 МО/мл (див. табл. 2).
Короткі підсумки
Підсумовуючи масив даних із наукових публікацій, інформаційно-довідкових матеріалів компанії Associates of Cape Cod. Inc., а також результати власних експериментальних досліджень, можемо говорити про низку переваг, властивих рекомбінантному реактиву (rCR) порівняно з лізатом амебоцитів тваринного походження. Основні з них:
- Менша варіабельність реагенту від партії до партії, що підвищує внутрішньолабораторну зіставність результатів і відтворюваність критеріїв придатності стандартної кривої
- Унеможливлення хибнопозитивних результатів через індиферентність до (1,3)-β-D-глюканів і (1→ 4)-β-D-глюканів)
- Вища реакційна здатність до Helicobacter pylori GU2 в експериментальних дослідженнях із використанням PyroSmart NextGen®, ніж в інших рекомбінантних реагентів (rFC), і суттєво нижчий заважаючий рівень впливу кальцію гепарину
- Виявлення переваг за умов аналізу інтенсивно забарвлених розчинів
- Сприяння меншому використанню тварин у фармакопейному контролі відповідно до принципу 3Rs
ТОВ «Хімлаборреактив», офіційний представник компанії Associates of Cape Cod в Україні, забезпечує:
- Великий вибір реактивів і систем для аналізу вмісту ендотоксинів
- Методичний супровід, консультації та підбір оптимального рішення для будь-якого препарату (фахівці ХЛР постійно проходять навчання на базі потужностей виробника)
- Постачання з дотриманням умов перевезення й зберігання на сертифікованому складі
Звертайтеся до компанії «Хімлаборреактив», і ви отримаєте найкращі рішення для контролю якості у фармацевтичній галузі!
Тетяна Леонтьєва,
науковий співробітник лабораторії фармакопейного аналізу ДП «Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів», Харків
Юлія Меркулова,
канд. біол. наук, провідний науковий співробітник лабораторії фармакопейного аналізу ДП «Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів», експерт Європейської фармакопеї
Анна Журба,
провідний фахівець Відділу хімічних реактивів компанії ХЛР