Компания «Химлаборреактив» – лидер в поставке лабораторного оборудования в Украине. Благодаря нашему партнерству со многими мировыми производителями отечественные предприятия получают инновационные решения, отвечающие международным стандартам. В активе ХЛР – постоянное обновление и расширение ассортимента продукции, профессиональный сервис и экспертное сопровождение от специалистов компании, что гарантирует квалифицированную поддержку в выборе оборудования, его обслуживании, а также обучении персонала.

Современное оборудование для анализа и контроля качества в фармацевтике

Одно из важных направлений деятельности ХЛР – обеспечение фармацевтической отрасли современными приборами, в частности, системами аналитического оборудования для жидкостной хроматографии.

Сфера фармисследований и разработок стремительно развивается, и без хроматографических методов уже трудно представить анализ и контроль качества, ведь с их помощью можно более глубоко и обоснованно подходить к интерпретации результатов.

Например, серьезная задача – разделение пиков хроматограммы, что в первую очередь вызвано сложностью анализируемых образцов. В их составе часто бывает несколько соединений, которые могут коэлюировать, а это приводит к перекрытию пиков и существенно усложняет количественное определение и идентификацию. Для эффективного разделения пиков нужны два условия, которые бывает трудно выполнить: достаточная квалификация персонала (специализированные знания и опыт в хроматографических методах), а также, конечно, время.

Рециркуляционная хроматография с приборами KNAUER

Это действенный метод для различных применений, объединяющий их в общей задаче – отделении трудноразделяемых веществ. Общий принцип для всех подходов подразумевает, что частично разделенные аналиты несколько раз перенаправляются через колонку (имитация нескончаемой длины колонки). Все эти опции доступны в жидкостных хроматографах от KNAUER – немецкого производителя систем аналитического оборудования, которого в Украине эксклюзивно представляет ООО «Химлаборреактив».

Далее речь пойдет об образцовой смеси двух стевиолгликозидов, но есть и другие примеры, такие как разделение хиральных соединений. Этот принцип также применяется в препаративной хроматографии для достижения более высокой чистоты соединений, несмотря на загрузку большего количества образца по сравнению с однократным прогоном. Общий принцип рециркуляционной хроматографии заключается в многократном перенаправлении интересующих нас пиков через колонку. Так имитируется бесконечная длина колонки, и в результате мы имеем лучшее разрешение целевого пика.

Рассмотрим два метода рециркуляционной хроматографии для лучшего разделения пиков.

Метод 1 – с рециркуляцией элюента

Это классический метод, когда перед входом насоса устанавливается Т-образный переходник и соединяется с многопозиционным клапаном, выполняющим функцию клапана фракционирования и расположенным после детектора (рис. 1).

Далее при помощи двухпортового шестипозиционного инжекторного клапана вводится образец, а клапан фракционирования переводится в положение рециркуляции. Образуется замкнутый контур. Интересующие нас соединения при помощи Т-образного фитинга перенаправляются в основной поток. Пройдя главный насос, соединения снова разделяются на стационарную фазу. Цикл повторяется, пока не будет достигнуто целевое разрешение или расширение пика не будет препятствовать дальнейшей рециркуляции. После каждого из циклов вещества оказываются детектором, который определяет степень разделения. В результате целевые вещества могут быть собраны с помощью клапана фракционирования.

Метод 2 – с использованием крана переключения колонок

В этом способе можно избежать перенаправления потока через основной насос – используется вторая колонка схожих размеров и еще один двухпозиционный шестипортовый клапан (рис. 2) В функции клапана рециркуляции. Колонки соединены так, что целевые соединения, выходя из первой колонки, попадают во вторую. Переключением клапана рециркуляции соединяется выход второй колонки со входом первой.

Подобно классической рециркуляции через насос, этот цикл переключения повторяется до достижения целевого разрешения или пока расширение пика не превысит один объем колонки. Время переключения клапана рециркуляции должно определяться заранее. Для этого выполняется один цикл с одной колонкой – так можно понять время содержания целевых соединений. В отличие от предыдущего метода, здесь детектор находится вне контура рециркуляции, так что разрешение целевого соединения проявляется, когда завершено разделение. Соответственно, процесс не получится контролировать в режиме онлайн, если нет второго сенсора. Для фракционирования после детектора подсоединяют многопозиционный клапан или коллектор фракций. Рециркуляцию растворителя можно проводить по обоим методам. Но метод рециркуляции через насос работает в замкнутом контуре, а для метода альтернативной перекачки требуется клапан фракционирования и пороговая функция для рециркуляции растворителя. Чтобы сравнить эффективность обоих методов рециркуляции, известный препаративный метод ВЭЖХ (VFD0170 и VFD0171) для разделения ребаудиозида А и стевиозида был масштабирован до полупрепаративного масштаба.

Подготовка образцов

Базовый раствор с содержанием 10 мг/мл стевиозида и 10 мг/мл ребаудиозида А готовится с использованием 30:70 ацетонитрила/дистиллированной воды (об. / об.) в качестве растворителя. Основной раствор разбавляется в соотношении 1:50 с раствором 30:70 ацетонитрила / дистиллированной воды (об. / об.), чтобы добиться целевой концентрации 0,2 мг/мл для каждого соединения. Образец отфильтровывается через RC-мембрану на 0,45 мкм (регенерированная целлюлоза) перед инжекцией.

Изучение результатов

Результат метода рециркуляции изображен на рис. 3. Детектор расположен внутри замкнутого контура, поэтому результат увеличения количества циклов можно получить за одно измерение. Увеличивая количество циклов, наблюдаем, как увеличивается разрешение пиков с соответствующим уменьшением высоты и увеличением ширины. Чтобы расширение пика стало критическим для повторения еще одного цикла, потребовалось семь циклов. Используя альтернативный метод с переключением колонок, мы видим, что с каждым последующим циклом разрешение также увеличивается (рис. 4).

После шести циклов получаем максимально возможное разрешение (1,29). Ширина пика достигает объема колонки, поэтому разрешение не может быть увеличено. Сравнение показано на рис. 5, где видно, что для максимального разрешения 1,13, достигнутого с помощью рециркуляции, потребовалось на три цикла меньше, чем с переключением колонок. Последний метод помог достичь максимального разрешения 1,29. Как и ожидалось, площади пиков для каждого цикла остаются неизменными, в то время как ширина пиков увеличивается. Во время процедуры по двум разным методам переработки ни один образец не был потерян (рис. 6).

Оба метода подтверждают, что с помощью рециркуляционной хроматографии можно проводить сложные разделения.

Плюсы и минусы классического метода рециркуляции через насос

Преимущество метода рециркуляции через насос состоит в достаточно простой конфигурации прибора. Разрабатывать метод тоже не сложно, потому что процесс можно контролировать в режиме онлайн с помощью детектора. Благодаря замкнутому циклу потребление растворителя низкое. Главный минус рециркуляции через насос – большой мертвый объем, который увеличивают любая трубка до и после колонки, головка насоса внутри или камера смешивания, а затем вещества частично перемешиваются после выхода из стационарной фазы, и происходит быстрое расширение пика. Кроме того, насос и система подачи элюента загрязняются образцом – в зависимости от назначения это может быть серьезным недостатком.

Характерные черты метода с краном переключения колонок

Если сравнивать с классическим подходом к рециркуляции через насос, метод с использованием крана переключения колонок устраняет некоторые из упомянутых минусов. В частности, образец никогда не контактирует непосредственно с системой подачи элюента, поэтому можно избежать его загрязнения. Мертвый объем также значительно меньше, ведь учитываются только капилляры между входами и выходами колонки и мертвый объем клапана рециркуляции. Таким образом, расширение пика происходит не так быстро с увеличением количества циклов, как по методу циклической перекачки через насос. Соответственно, и разрешение целевых пиков растет быстрее. В приведенном примере такого же разрешения можно достичь на три цикла раньше, что помогает сократить общее время выполнения. Одним из недостатков метода поочередной перекачки является необходимость второй колонки и клапана – это усложняет устройство. Процесс нелегко контролировать в режиме онлайн, так как детектор обычно находится вне контура рециркуляции. Однако метод альтернативной прокачки показывает лучшее разрешение в отношении целевых веществ, поэтому больше подходит для разделения образца.

Компания ХЛР – официальный поставщик жидкостных хроматографов KNAUER на территории Украины. Обращайтесь, и наши специалисты помогут сделать ваш хроматографический анализ более удобным и эффективным.

По материалам компании KNAUER