Компанія «Хімлаборреактив» – лідер у постачанні лабораторного обладнання в Україні. Завдяки нашому партнерству з багатьма світовими виробниками вітчизняні підприємства отримують інноваційні рішення, що відповідають міжнародним стандартам. В активі ХЛР – постійне оновлення й розширення асортименту продукції, професійний сервіс і експертний супровід від фахівців компанії, що гарантує кваліфіковану підтримку у виборі обладнання, його обслуговуванні, а також навчанні персоналу.

Сучасне обладнання для аналізу й контролю якості у фармацевтиці

Одним із важливих напрямів діяльності ХЛР є забезпечення фармацевтичної галузі сучасними приладами, зокрема системами аналітичного обладнання для рідинної хроматографії.

Сфера фармдосліджень і розробок нині стрімко розвивається, і без хроматографічних методів уже важко уявити аналіз та контроль якості, адже з їх допомогою можна більш глибоко й обґрунтовано підходити до інтерпретації результатів.

Наприклад, серйозне завдання – розділення піків хроматограми, що насамперед спричинено складністю аналізованих зразків. У їх складі часто буває кілька сполук, які можуть коелюювати, а це призводить до перекриття піків і суттєво ускладнює кількісне визначення й ідентифікацію. Для ефективного розділення піків потрібні дві умови, які буває важко виконати: достатня кваліфікація персоналу (спеціалізовані знання і досвід саме в хроматографічних методах), а також, звісно, час.

Рециркуляційна хроматографія з приладами від KNAUER

Це дієвий метод для різноманітних застосувань, який об’єднує їх у спільному завданні – відокремленні важкорозділюваних речовин. Загальний принцип для всіх підходів передбачає, що частково розділені аналіти кілька разів перенаправляються через колонку (імітація нескінченної довжини колонки). Усі ці опції доступні в рідинних хроматографах від KNAUER – німецького виробника систем аналітичного обладнання, якого в Україні ексклюзивно представляє ТОВ «Хімлаборреактив».

Далі йтиметься про зразкову суміш двох стевіолглікозидів, але є й інші приклади, як-от розділення хіральних сполук. Цей принцип також застосовується в препаративній хроматографії для досягнення вищої чистоти сполук, попри завантаження більшої кількості зразка порівняно з одноразовим прогоном. Загальний принцип рециркуляційної хроматографії полягає в багаторазовому перенаправленні піків, що нас цікавлять, через колонку. Так імітується нескінченна довжина колонки, і в результаті ми маємо кращу роздільну здатність цільового піку.

Розглянемо два методи рециркуляційної хроматографії для кращого розділення піків.

Метод 1 – з рециркуляцією елюенту

Це класичний метод, коли перед входом насоса встановлюється Т-подібний перехідник і з’єднується з багатопозиційним клапаном, який виконує функцію клапана фракціонування й розташований після детектора (рис. 1).

Далі за допомогою двопортового шестипозиційного інжекторного клапана вводиться зразок, а клапан фракціонування переводиться в положення рециркуляції. Утворюється замкнутий контур. Сполуки, що цікавлять нас, за допомогою Т-подібного фітингу переспрямовуються в основний потік. Пройшовши головний насос, сполуки знову розділяються на стаціонарній фазі. Цикл повторюється, доки не буде досягнуто цільової роздільної здатності або розширення піку не перешкоджатиме подальшій рециркуляції. Після кожного із циклів речовини виявляються детектором, який визначає ступінь розділення. У результаті цільові речовини можуть бути зібрані за допомогою клапана фракціонування.

Метод 2 – з використанням крана перемикання колонок

У цьому методі можна уникнути переспрямування потоку через основний насос – використовується друга колонка ідентичних розмірів і ще один двопозиційний шестипортовий клапан (рис. 2) у функції клапана рециркуляції. Колонки з’єднані так, що цільові сполуки, виходячи з першої колонки, потрапляють у другу. Перемиканням клапана рециркуляції з’єднується вихід другої колонки зі входом першої.

Подібно до класичної рециркуляції через насос, цей цикл перемикання повторюється до досягнення цільової роздільної здатності або допоки розширення піку не перевищить один об’єм колонки. Час перемикання клапана рециркуляції має визначатися заздалегідь. Для цього виконується один цикл з однією колонкою – так можна зрозуміти час утримування цільових сполук. На відміну від попереднього методу, тут детектор перебуває поза контуром рециркуляції, тож роздільна здатність цільової сполуки виявляється, коли завершено розділення. Відповідно, процес не вийде контролювати в режимі онлайн, якщо немає другого детектора. Для фракціонування після детектора під’єднують багатопозиційний клапан або колектор фракцій. Рециркуляцію розчинника можна проводити за обома методами. Але метод рециркуляції через насос працює в замкнутому контурі, а для методу альтернативного перекачування потрібен клапан фракціонування й порогова функція для рециркуляції розчинника. Щоби порівняти ефективність обох методів, відомий препаративний метод ВЕРХ (VFD0170 і VFD0171) для розділення ребаудіозиду А та стевіозиду було масштабовано до напівпрепаративного масштабу.

Підготовка зразків

Базовий розчин зі вмістом 10 мг/мл стевіозиду та 10 мг/мл ребаудіозиду А готується з використанням 30:70 ацетонітрилу / дистильованої води (об. / об.) як розчинника. Основний розчин розводиться у співвідношенні 1:50 із розчином 30:70 ацетонітрилу / дистильованої води (об. / об.), щоб добитися цільової концентрації 0,2 мг/мл для кожної сполуки. Зразок фільтрується через RC-мембрану на 0,45 мкм (регенерована целюлоза) перед інжекцією.

Вивчення результатів

Результат методу рециркуляції зображено на рис. 3. Детектор розміщений усередині замкнутого контуру, тому результат збільшення кількості циклів можна отримати за одне вимірювання. Збільшуючи кількість циклів, спостерігаємо, як збільшується роздільна здатність піків із відповідним зменшенням висоти й збільшенням ширини. Щоб розширення піку стало критичним для повторення ще одного циклу, знадобилося сім циклів. Використовуючи альтернативний метод із перемиканням колонок, бачимо, що з кожним наступним циклом роздільна здатність також збільшується (рис. 4).

Після шести циклів отримуємо максимальну можливу роздільну здатність (1,29). Ширина піку досягає об’єму колонки, тому роздільна здатність не може бути збільшена. Порівняння показано на рис. 5, де видно, що для максимальної роздільної здатності 1,13, досягнутої за допомогою рециркуляції, знадобилося на три цикли менше, ніж із перемиканням колонок. Останній метод допоміг досягнути максимальної роздільної здатності 1,29. Як і очікувалося, площі піків для кожного циклу залишаються незмінними, тоді як ширина піків збільшується. Під час процедури за двома різними методами перероблення жоден зразок не був втрачений (рис. 6).

Обидва методи підтверджують, що за допомогою рециркуляційної хроматографії можна проводити складні розділення.

Плюси й мінуси класичного методу рециркуляції через насос

Перевага методу рециркуляції через насос полягає в досить простій конфігурації приладу. Розробляти метод теж не складно, бо процес можна контролювати в режимі онлайн за допомогою детектора. Завдяки замкнутому циклу споживання розчинника є низьким. Головний мінус рециркуляції через насос – великий мертвий об’єм, котрий збільшують будь-яка трубка до й після колонки, головка насоса всередині або камера змішування, а далі речовини частково перемішуються після виходу зі стаціонарної фази, і відбувається швидке розширення піку. Крім того, насос і система подавання елюенту забруднюються зразком – залежно від призначення це може бути серйозним недоліком.

Характерні риси методу з краном перемикання колонок

Як порівняти з класичним підходом до рециркуляції через насос, метод із використанням крана перемикання колонок усуває деякі зі згаданих вище мінусів. Зокрема, зразок ніколи не контактує безпосередньо із системою подавання елюенту, тож можна уникнути його забруднення. Мертвий об’єм також значно менший, бо враховуються тільки капіляри між входами й виходами колонки та мертвий об’єм клапана рециркуляції. Отже, розширення піку відбувається не так швидко зі збільшенням кількості циклів, як за методу циклічного перекачування через насос. Відповідно, і роздільна здатність цільових піків зростає швидше. У наведеному прикладі такої самої роздільної здатності можна досягти на три цикли раніше, що допомагає скоротити загальний час виконання. Одним із недоліків методу почергового перекачування є необхідність другої колонки й клапана – це ускладнює пристрій. Процес нелегко контролювати в режимі онлайн, бо детектор зазвичай перебуває поза контуром рециркуляції. Проте метод альтернативного прокачування показує кращу роздільну здатність щодо цільових речовин, тому більше підходить для розділення зразка.

Компанія ХЛР – офіційний постачальник рідинних хроматографів KNAUER на території України. Звертайтеся, і наші фахівці допоможуть зробити ваш хроматографічний аналіз іще зручнішим та ефективнішим.

За матеріалами компанії KNAUER