Очищення білків – процес, спрямований на виділення цільового білка з потрібним ступенем чистоти й збереженням його функціональних властивостей. На відміну від багатьох низькомолекулярних сполук, білки – складні й чутливі біомолекули, структура та функціональна активність яких легко змінюються під впливом зовнішніх факторів. Надмірний тиск, різкі зміни pH, висока температура або невдало підібраний розчинник можуть вплинути на результат аналізу і спричинити часткову або повну денатурацію цільового продукту.

Саме тому для роботи з білками, пептидами, антитілами й ферментами застосовують методи, здатні поєднати ефективне розділення з м’якими умовами процесу. Одним із таких рішень є FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) – швидкісна рідинна хроматографія білків, розроблена спеціально для біомолекул. Цей підхід дає змогу працювати з чутливими зразками в контрольованих умовах і отримувати відтворюваний результат без втрати їхніх властивостей.

Принцип катіонообмінної хроматографії

Один із найпоширеніших режимів FPLC – іонообмінна хроматографія, яка дає змогу розділяти білки за зарядом. На прикладі системи KNAUER AZURA® Bio та катіонообмінних колонок Sepapure® можна добре побачити, як цей принцип працює на практиці та як вибір сорбенту впливає на результат очищення.

Іонообмінна хроматографія ґрунтується на різниці в заряді молекул. Для білків ключовим параметром є ізоелектрична точка (pI) – значення pH, за якого молекула не має сумарного електричного заряду. Якщо pH середовища нижчий за pI білка, молекула набуває позитивного заряду. Саме в такому стані вона може взаємодіяти з негативно зарядженими функціональними групами катіонообмінної смоли.

Рис. 1. Принцип катіонообмінної хроматографії

На практиці процес відбувається так. На початковому етапі підбирають буфер із відповідним pH і невисокою концентрацією солі, щоб білки могли ефективно зв’язатися із сорбентом. Після цього запускають елюювання, найчастіше за допомогою лінійного сольового градієнта. Іони солі поступово конкурують із білками за центри зв’язування на сорбенті й витісняють їх з колонки. Молекули, що взаємодіють із сорбентом слабше, виходять з колонки раніше, а сильніше зв’язані – пізніше, за вищої концентрації солі. Саме це й забезпечує розділення компонентів суміші.

Сильні та слабкі катіонообмінники

Іонообмінні сорбенти поділяються на:

Сильні катіонообмінники
Слабкі катіонообмінники

Сильні катіонообмінники зберігають заряд у широкому діапазоні pH, тому дають більш стабільну поведінку в різних умовах. Слабкі катіонообмінники мають pH-залежну іонообмінну ємність, а отже, відрізняються за селективністю. На практиці це означає, що вибір типу сорбенту безпосередньо впливає на якість очищення. Для одних білків кращий результат дає сильний катіонообмінник, для інших – слабкий.

Приклад розділення модельних білків

У матеріалі для демонстрації використано три модельні білки: цитохром C, лізоцим і рибонуклеазу A. Усі вони мають відносно високі значення pI, тому підходять для катіонообмінної хроматографії.

Особливу увагу в цьому прикладі приділено порівнянню двох колонок:

Sepapure CM – слабкий катіонообмінник
Sepapure SP – сильний катіонообмінник

Модельні білки, використані для демонстрації розділення:

Цитохром C – гемовмісний білок, що відіграє ключову роль у мітохондріальному ланцюзі перенесення електронів. Застосовується у складі комплексної терапії як засіб, що поліпшує тканинне дихання, за таких станів: асфіксія новонароджених; період перед і після оперативного втручання з приводу вроджених та набутих вад серця; період ремісії бронхіальної астми й астматичні стани; хронічна пневмонія; хронічна ішемічна хвороба серця та інфаркт міокарда; повторні фібриляції або тахікардія шлуночків; вірусний гепатит; стареча дегенерація сітківки; отруєння снодійними препаратами або окисом вуглецю.
Лізоцим – фермент із бактеріолітичною, протизапальною та імуномодулюючою дією. Застосовується у складі комплексної терапії в разі функціональних розладів шлунково‑кишкового тракту в немовлят, а також як допоміжний засіб у місцевій терапії оперізувального герпесу (Herpes zoster) та простого герпесу (Herpes simplex).
Рибонуклеаза A (RNase A) – фермент, що каталізує гідроліз фосфодіестерних зв’язків у молекулах РНК, відіграючи ключову роль у деградації та обробленні РНК. RNase A широко використовується в молекулярній біології, біотехнології та фармацевтичних дослідженнях, зокрема для очищення плазмід, ізоляції високоякісної геномної ДНК, видалення залишкової РНК з ДНК-зразків, а також для вивчення структури й функцій РНК.

Результати розділення білків

Рис. 2. Хроматограми розділення рибонуклеази A (1), цитохрому C (2) та лізоциму (3) на слабкій (світло-блакитна лінія) і сильній (темно-синя лінія) катіонообмінних колонках; сіра лінія – сигнал кондуктометричного детектора

За умов низької концентрації солі всі три білки ефективно зв’язувалися із сорбентом.

Рибонуклеаза A елюювалася першою завдяки нижчому значенню pI
Цитохром C виходив другим піком
Лізоцим елюювався останнім

Порівняння результатів на Sepapure CM (слабкий катіонообмінник) та Sepapure SP (сильний катіонообмінник) чітко демонструє різницю в селективності сорбентів, що дає змогу оптимізувати очищення під конкретні біомолекули.

Система KNAUER AZURA® Bio

Для очищення використовувалася система біоочищення KNAUER AZURA® Bio, до складу якої входять:

Насос AZURA P 6.1L LPG, який не містить металів у частинах, що контактують із рідиною, з головкою 10 мл
Модуль AZURA ASM 2.1L з краном для ручного введення зразка
УФ-детектор UVD 2.1S
Кондуктометричний детектор AZURA CM 2.1S
Колектор фракцій Foxy R1

Така конфігурація забезпечує контроль ключових етапів очищення: стабільне подавання елюентів, введення зразка, реєстрацію білкових піків, контроль сольового градієнта і збір фракцій. Для FPLC це важливо, оскільки від стабільності системи в усіх вузлах елюювання залежить відтворюваність результатів.

Рис. 3. Схематичне зображення хроматографічного комплексу KNAUER AZURA® Bio, задіяного для
очищення білків

Надійне рішення для завдань з біоочищення

Приклад із використанням системи KNAUER AZURA® Bio та катіонообмінних колонок Sepapure® показує, що FPLC є ефективним інструментом для очищення білків у м’яких і контрольованих умовах. Катіонообмінна хроматографія допомагає розділяти білки за зарядом, а вибір між сильним і слабким катіонообмінником – гнучко керувати селективністю процесу.

Саме поєднання коректно підібраної методики, відповідного сорбенту і стабільної хроматографічної системи дає змогу отримати відтворюване очищення й адаптувати процес під конкретні завдання лабораторії.

Звертайтеся до компанії «Хімлаборреактив» – офіційного дистриб’ютора обладнання Knauer в Україні. Ми забезпечуємо професійний підбір, постачання, інсталяцію та введення в експлуатацію обладнання, а також надаємо повний технічний супровід, сервісне обслуговування й навчання персоналу, гарантуючи надійну та ефективну інтеграцію рішень Knauer.